A：提前准备hPSC细胞、提前预冷冰盒及所需无菌吸头、离心管；

B：分装NovoMatrix基质胶：提前将基质胶放在4℃过夜融化，用预冷过的冰盒盛放并转移到生物安全柜内，按照500μL/支分装后冻存在-80℃冰箱，避免反复冻融；

C：配制干细胞铺底液：使用预冷的hPSC完全培养基按照1:100（v/v）稀释干细胞专用基质胶（Cat#NMS-G）;

D：准备hPSC完全培养基

E：配置各培养阶段所需的分化培养基，配制好的完全培养基在使用前需要37℃预热或平衡至室温

提示：细胞因子种类及用量仅供参考，可根据实际反应体系进行调整

A、hPSC传代培养（以6孔板为例）

（1）取1mL干细胞铺底液加入一个孔中，摇晃均匀覆盖皿底，置于37℃恒温培养箱中处理1h；

（2）取出在hPSC完全培养基中维持培养且汇合度达到85%-90%的hPSC，吸出培养基，加入1mL D-PBS洗一次，吸出后加入1mL干细胞消化液，摇晃均匀，置于37℃恒温培养箱中消化5min；

（3）消化完成后，加入1mL hPSC完全培养基，轻轻吹下细胞，转移至15mL离心管中，离心1000rpm，3min；

（4）吸出铺底的基质胶溶液，每个六孔板加入2mL hPSC完全培养基；

（5）去上清，加入1mL hPSC完全培养基重悬细胞，按1:6-1:10的比例传代，并加入终浓度为5μM的Y-27632，轻轻晃匀，置于37℃恒温培养箱中培养。

B、定型内胚层分化

（1）培养hPSC至接合密度为80%左右，去除孔中培养基并加入2mL内胚层分化培养基，培养72h;

Figure 1.诱导3天后细胞状态

C、肝祖细胞

（1）去除内胚层分化培养基，加入2mL 肝祖分化培养基，培养24h后，应出现零散分布的局部细胞应出现凝聚现象，且每天增多，至第9-10天在培养体系中会出现少量的悬浮;

Figure 2.诱导9天后细胞状态

（2）Day10：加入1mL 干细胞消化液，将孔中细胞团解离成单细胞;

D.肝祖细胞包埋与肝祖类器官培养

（1）包埋前，将NovoMatrix类器官专用基质胶（Cat#NMO-G-PF）在4℃下解冻过夜;

（2）在37℃培养箱中加热24孔板;

（3）根据收集球体的数量，加入合适量基质胶使每40μL基质胶中含有3000-10000个左右的肝祖细胞，轻轻混匀;

注意：基质胶占比不低于70%

（4）按照24孔板每孔40μL种板，37℃倒置凝固20min;

（5）加入500μL的肝祖分化培养基培养，每三天更换一次培养基;

Figure 3.肝祖类器官形态图

E.肝祖类器官诱导培养为肝实质类器官

（1）将肝祖类器官用干细胞消化液解离成单细胞，按照每孔10000~20000个细胞接种24孔板;

（2）在37℃培养箱中加热24孔板;

（3）加入500μL的肝实质分化培养基培养，每三天更换一次培养基，后续可进行免疫荧光等鉴定;

Figure 4.肝实质类器官形态图

近岸蛋白可提供科研级和GMP级hPSC诱导培养肝脏类器官所需细胞因子，高活性、低内毒素、高批间一致性；同时提供成体组织来源的肝脏类器官完全培养基，包括扩增培养基和分化培养基，助力肝脏类器官体外培养。

Measured by its ability to induce IL-11 secretion by Saos2 human osteosarcoma cells. The specific activity is ≥ 1.0 × 10⁶ IU/mg (QC verified).

Measured by its ability to induce SMAD signaling in 293-Activin A Res cells. The ED50 for this effect is 1-5 ng/mL.(QC verified).

Measured by its ability to induce Topflash reporter activity in HEK293T human embryonic kidney cells.The ED50 for this effect is 20-80 ng/ml(QC verified).