产品内容： 
酸性提取液：25mL×1 瓶，4℃保存； 
碱性提取液：25mL×1 瓶，4℃保存； 
试剂一：液体 5mL×1 瓶，4℃保存； 
试剂二：液体 1.5mL×1 支，4℃保存 
试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 1.6mL 双蒸水，混匀，4℃保存一周； 
试剂四：粉剂×1 支，4 ℃保存，用时加入 1.9mL 双蒸水，混匀，4℃保存一周； 
试剂五：液体 0.7mL×1 支，4 ℃保存； 
试剂六：液体 10mL×1 瓶，4 ℃保存； 
试剂七：自备。19.2mL 乙醇和 0.8mL 蒸馏水充分混合备用。
NAD 标准品：粉剂×1 支，-20℃保存。临用前加入 1.5mL 蒸馏水，即 2umol/mL，将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NAD 标准溶液备用。 
NADH 标准品：粉剂×1 支，-20℃保存。临用前加入 1.4mL 蒸馏水，即 2umol/mL，将其稀释为 1.25nmol/mL 的 NADH 标准溶液备用。
操作步骤： 
一、NAD+和 NADH 的提取： 
1、血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取： 
NAD+的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 酸性提取液，煮沸 5min (盖紧，以防止水分 散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min；取上清 200uL，加入等体积碱性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清，冰上保存待测。 
NADH 的提取：取 0.1mL 血清（浆），加入 0.5mL 碱性提取液，煮沸 5min(盖紧，以防止水分 散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积酸性提取液；混匀，10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。 
2、组织中 NAD+和 NADH 的提取： 
NAD+的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 酸性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防 止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积碱性提取液混匀， 10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。 
NADH 的提取：称取约 0.1g 组织，加入 0.5mL 碱性提取液，冰浴研磨，煮沸 5min(盖紧，以防 止水分散失)，冰浴冷却后，10000g 4℃离心 10min，取上清 200uL，加入等体积酸性提取液混匀， 10000g 4℃离心 10min，取上清,冰上保存待测。 
3、细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取： 
NAD+的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 酸性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％ 或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃ 离心 10min，取上清,冰上保存待测。 
NADH 的提取：收集 500 万细胞或细菌，加入 0.5mL 碱性提取液，超声波破碎 1min（强度 20％ 或 200W，超声 2s，停 1s），煮沸 5min(盖紧，以防止水分散失)，冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min，取上清液 200uL 至另一新的离心管中，加入等体积的酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4℃ 离心 10min，取上清,冰上保存待测。 
 
二、测定步骤： 
1、可见分光光度计/酶标仪调节波长至570nm，蒸馏水调零。
2、 操作表（在1.5ml棕色EP管中按下表依次加样） 
试剂名称
对照管(μL)
测定管(μL)
NAD 或 NADH 标准管
空白管
上清液
10
10
 
 
标准溶液
 
 
10
 
蒸馏水
 
 
 
10
试剂六
100
 
 
 
试剂一
50
50
50
50
试剂二
15
15
15
15
试剂三
15
15
15
15
试剂四
15
15
15
15
试剂五
7
7
7
7
充分混匀，室温避光静置20min
试剂六
 
20
20
20
充分混匀，静置5min后，15000rpm，25℃离心15min，弃上清，沉淀中加入：
试剂七
200
200
200
200
混匀， 570nm 下比色，读取吸光值ΔA 测定=A 测定管-A 对照管，NAD 标准管的记为ΔA 标准 1=A 标准管 1-A 空白管。 NADH 标准管的记为ΔA 标准 2=A 标准管 2-A 空白管。空白管只需做一 到两次。 
 
注意事项： 
1、操作过程应避光。不可将试剂一、二、三和四混合后再加，必须分开加。 
2、反应过程要注意避光。 
3、当吸光值大于 1 时，建议稀释后测量，计算公式中应当乘以稀释倍数。 
 
NAD+含量的计算 
1、 血清（浆）中 NAD+含量计算 
NAD+含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷V 血清=12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 1 
2、组织、细菌、细胞中 NAD+含量计算
 (1)按样本蛋白浓度计算 
NAD+ (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷(V 提取×Cpr) = 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
 (2)按样本鲜重计算 
NAD+ (nmol/g 鲜重）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷W= 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 1÷W
 (3)按细菌或细胞密度计算 
NAD+ (nmol/10 4cell）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 1÷C 标）×V 提取÷500=0.0025×ΔA 测定÷ΔA 标准 1
 
 NADH 含量的计算 
1、 血清（浆）中 NADH 含量计算 
NADH 含量(nmol/mL）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷V 血清 =12.5×ΔA 测定÷ΔA 标准 2 
2、组织中 NADH 含量计算 
(1)按样本蛋白浓度计算 
NADH (nmol/mg prot）=ΔA 测定÷（ΔA 标准 2÷C 标）×V 提取÷(V 样品×Cpr) = 1.25×ΔA 测定÷ΔA 标准 2