北京索莱宝科技有限公司  张净花  010-56371217  13426459985

一、试剂盒组成：

试剂Ⅰ 液体 1 瓶 100ml（4℃保存）

试剂Ⅱ 液体 1 支 130 l（4℃保存）

试剂Ⅲ 液体 1 瓶 20ml（4℃保存）

试剂Ⅳ 液体 1 瓶 2.5ml（4℃避光保存）

试剂Ⅴ 粉剂 4℃保存，用前 2.5ml 蒸馏水溶解

试剂Ⅵ 液体 1 支 12.5 l用前0.25ml蒸馏水稀释

标准品 粉剂 1mg（4℃避光保存）

二、实验原理

氧化型谷胱甘肽（GSSG）是谷胱甘肽（GSH）的氧化形式，又称为二硫代谷胱甘肽，是 两分子的谷胱甘肽氧化而成。GSSG 会被谷胱甘肽还原酶还原成 GSH,因此机体中大多数是以 还原型方式存在。测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所 处的氧化还原状态。

本试剂盒利用谷胱甘肽能和 5,5’-二硫代-双-（2-**苯甲酸）（5,5’ -dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生 2-**-5-巯基苯甲酸，2-**-5-巯基 苯甲酸在波长 412nm 处具有最大光吸收的特点，通过 2-乙烯吡啶抑制样品中原有的还原型 谷胱甘肽，然后利用谷胱甘肽还原酶将 GSSG 还原为 GSH，借此测定氧化型谷胱甘肽的含量。

三、实验仪器

Solarbio 分析天平、微量匀浆器（规格 2ml）、低温离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计 或酶标仪、微量比色皿或 96 孔板。

四、操作步骤

1、样品的处理

组织处理

新鲜组织首先用 PBS 冲洗 2 次，然后称取动物组织或者植物组织 0.1g。加入用试剂Ⅰ润洗 过的匀浆器中（匀浆器提前放冰上预冷）；然后加入 1ml 试剂Ⅰ（组织/试剂Ⅰ比例保持不变 即可），迅速冰上充分研磨（使用液氮研磨效果更好）；10000rpm 4℃离心 10min；取上清液 放置于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

血液处理 血浆：

将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，吸取上层血浆到另一支试管中，加入等 体积的试剂Ⅰ, 4℃，8000g 离心 10 分钟,将上清移入新的试管中放置于 4℃待测，若暂时不 能完成测试可放于-80℃保存（可保存 10 天）。

血细胞：

将收集的抗凝血于 4℃，600g 离心 10 分钟，弃去上层血浆用 3 倍体积的 PBS 清洗 3 次（用 PBS 重悬血细胞，600g 离心 10 分钟），加入等体积试剂Ⅰ，混匀后 4℃放置 10 分 钟，8000g 离心 10 分钟，吸取上清放于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可 保存 10 天）。 细胞处理 收集不少于 10 8个细胞，首先用 PBS 清洗细胞 2 次（PBS 重悬细胞，600g 离心 10 分钟），加 入 3 倍细胞沉淀体积的试剂Ⅰ重悬细胞，反复冻融 2-3 次（可在液氮中冻结，37℃水浴中溶 解），8000g 离心 10 分钟，收集上清于 4℃待测，若暂时不能完成测试可放于-80℃保存（可 保存 10 天）。

2、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，分光光度计蒸馏水调零。

3、试剂Ⅱ放置 37℃（哺乳动物）或 25℃（一般物种）水浴中保温 30min。

4、标准品的稀释：将标准品用 1ml 蒸馏水溶解(4℃保存)，浓度为 1mg/ml。取适当溶液配 制浓度为 25 g/ml、20 g/ml、12.5 g/ml、6.25 g/ml、3.125 g/ml、0 g/ml 的标准 品（试剂Ⅰ十倍稀释后进行稀释）。

5、取 0.5ml 离心管，加入 20 L 稀释好的标准品或样品，加入 1 L 试剂Ⅱ，混匀后 37℃ 孵育 30 分钟。

6、制作标准曲线 孵育完成后标准管依次加入 140μ L 试剂Ⅲ，20 μ L 试剂Ⅳ，20 μ L 试剂Ⅴ，2 μ L 试 剂Ⅵ，迅速混匀后，测定 412nm 处 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2。吸光度（A2-A1）为横坐 标，浓度为纵坐标做标准曲线。

7、样品管依次加入 140μ L 试剂Ⅲ，20 μ L 试剂Ⅳ，20 μ L 试剂Ⅴ，2 μ L 试剂Ⅵ， 迅速混匀后，测定 412nm 处 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2。

五、GSSG 含量计算

将样品△A（即 A2 减去 A1）带入标准曲线公式，即可计算出每 0.1g 组织或相应血液、细胞 样品中氧化型谷胱甘肽的含量。

六、注意事项

1、样品处理需匀浆完全，若当天不能完成测量，可放-80℃保存。

2、若不确定样品中 GSSG 含量的高低，可稀释几个梯度后再进行测量。

3、此方法利用酶促反应速率计算底物浓度，尽量准确在 30 秒和 150 秒处完成读数。

4、因为试剂Ⅰ中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。

5、本试剂盒所配制的试剂除测定 96 个样品外，至少可做 4 次标准曲线

相关文献：

《Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin‐induced skeletal muscle injury》 作者:Ming Song , Fang‐fang Chen , Yi‐hui Li,  Lei Zhang , Feng Wang,  Ran‐ran Qin  ,Zhi‐hao Wang , Ming Zhong , Meng‐xiong Tang , Wei Zhang , Lu Han 期刊:Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle 影响因子:10.754 PMID:29152896
《Composition Analysis by UPLC-PDA-ESI (?)-HRMS and Antioxidant Activity Using Saccharomyces cerevisiae Model of Herbal Teas and Green Teas from Hainan》 作者: Hua Li, Lanying Wang and Yanping Luo 期刊:molecules 影响因子:3.06 PMID:30301226
《Cell death induced by α-terthienyl via reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the midgut of Aedes aegypti larvae》 作者:JieZhangaShakilAhmadaLan-YingWangaQianHanbJian-ChunZhangaYan-PingLuo 期刊:Free Radical Biology and Medicine 影响因子:5.657 PMID:31022448