复孔的重现性往往事关实验结果的可信度，“复孔平台期信号高低不一，我的Ct值会不会受影响？”——几乎每一个刚接触qPCR的实验者都曾指着屏幕里分叉的终点荧光信号发出灵魂拷问。今天，本文将深入解答这一疑问：复孔平台期信号差异究竟会不会影响实验结果？

要想解决这个问题，先来了解下什么是平台期。通常，在理想情况下，PCR扩增应遵循每循环DNA量翻倍的指数增长规律。然而在实际反应中，随着循环数增加，反应组分如Taq酶、dNTP和引物逐渐消耗，同时副产物不断积累，导致扩增效率逐渐下降，扩增曲线呈现典型的“S”型，可划分为基线期、指数增长期和平台期三个阶段。

一 基线期

通常为反应开始后的前3至15个循环。此阶段，扩增产物量较少，荧光信号强度尚未超过仪器背景水平，因此无法检测到到有效的荧光信号变化。

二 指数增长期

是扩增效率最高的阶段，接近理论上的指数增长。该阶段扩增差异尚未显著放大，复孔之间的荧光信号较为一致。通常将荧光阈值设定于该区间，当荧光信号超过阈值时对应的循环数即为Ct值。此时，复孔间的Ct值重复性良好，一般要求△Ct小于0.5。

三 平台期

出现在扩增后期，此时反应组分大量消耗，副产物抑制作用增强，扩增速率显著减缓。累积的微小差异被进一步放大，不同复孔在平台期的荧光信号可能出现较大差异，因此该阶段的信号数据通常不用于定量比较。

图1. 扩增曲线的三个阶段

以下图（图2）为例，将293T-cDNA为模板，扩增GAPDH基因，90个复孔。

图2. 同一样品的90个复孔扩增曲线图

由图可见，该实验的复孔重复性非常好，△Ct<0.5，符合MIQE标准，数据有效，但平台期的荧光信号值均有差异。

因此，数据的有效性和复孔平台期荧光信号关系不大，主要与复孔间的△Ct有关，MIQE标准是△Ct＜0.5。

在复孔△Ct<0.5的情况下，复孔平台期不同并不影响实验结果，那有没有办法可以让复孔平台期荧光信号尽量一致呢？

1. 确保加样的准确性：1）qPCR各组分完全化冻后需要混匀；2）采用预混的方式进行加样，保证体系的均一性，可以将除模板以外的试剂进行预混，分注至各管中；3）模板浓度高时，可将模板稀释，提高加样体积，减少加样误差。

2. 确保移液的精准度：加样过程需确保移液枪未出现漏气、漏液的情况，避免使用精准度差的移液枪或者不配套的枪头。

3. 体系混匀并进行离心：体系加完后要用移液枪吹打并进行离心，以防试剂挂壁或者体系中有气泡造成实验结果不准确。

4. qPCR试剂的选择：选择“预混液”形式的qPCR试剂，反应体系只需加入引物和模板，大大简化实验的操作步骤，减少了加样误差。

读完本篇文章，相信你就不会再纠结复孔平台期信号不同的问题了。

四 产品推荐

即使加样1000管，也能保证体系的正确配置

—可示踪qPCR染料法预混液2×Color qPCR Fluore Green Master Mix (No/Low/High ROX)（Cat#N132134/N132135/N132136）

图 Arcegen qPCR体系配置清晰示踪图

蓝色：单试剂体系；黄色：单模板体系；绿色：完全体系/上机体系

产品特点：

移液追踪：即使手动加样1000管，也能保证体系的正确配置

扩增优异：在7个数量级线性范围内展现良好的线性

精准度好：可精准区分2倍浓度差异模板

重复性好：10¹数量级拷贝质粒，20复孔偏差SD<0.2

稳定可靠：反应体系可于常温放置24小时，产品反复冻融20次性能如常

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